iSpinach este un lanț de oligonucleotide (un aptamer), ce poate interacționa cu o proteină fluorescentă, formând un complex ce prezintă o fluorescență mai mare comparativ cu proteina de care s-a legat.
Tehnica Spinach
iSpinach este o versiune îmbunătățită a Spinach. Spinach este o secvență scurtă de ARN, care se leagă la colorantul DFHBI (3, 5 – difluoro – 4 – hidroxi benziliden imidazolinonă). Acest colorant prezintă următoarele avantaje: nu este toxic, este ușor permeabil pentru membranele celulare și nu interacționează cu componentele citoplasmatice. În stare liberă prezintă fluorescență slabă. Fluorescența sa poate crește de până la 200 de ori când interacționează cu componente specifice. Spinach nu este stabil termic, ceea ce a condus la dezvoltarea unei versiuni mai eficiente, iSpinach.
Structura iSpinach
iSpinach este format dintr-o tetradă de helixuri ce conțin guanină. Poate forma unul sau mai multe lanțuri. Stabilitatea structurii este asigurată de ioni de potasiu, aceștia având un rol important în gradul de intensitate al fluorescenței.
Avantajele utilizării iSpinach
- Dimensiunile sunt mai reduse comparativ cu versiunile anterioare de Spinach. Mărimea mică favorizează o penetrare mai bună prin membrana celulară.
- Fluorescența este mai intensă, datorită unei afinități crescute față de DFHBI, dar și datorită unei mai eficiente modalități de împachetare a lanțurilor de oligonucleotide.
- Temperatura de topire a complexului format de către iSpinach și DFHBI este crescută cu 8°C, comparativ cu versiunile anterioare.
- Stabilitatea nu depinde doar de ionii de potasiu, dar și de ionii de sodiu, cesiu, litiu. Ionii de sodiu, precum și cei de potasiu au rolul de a crește intensitatea fluorescenței.
- Capacitatea lanțurilor de a se împacheta asigură o afinitate crescută pentru DFHBI.
- Prin utilizarea acestei versiuni se obțin rezultate mai calitative, comparativ cu cele obține cu alte versiuni de Spinach.
Aplicațiile iSpinach
- Este utilizat în principal pentru a vizualiza componente ale citoplasmei, precum ribozomii. Prin utilizarea acestei tehnici, se poate măsura și activitatea ribozomilor. De asemenea, tehnica poate fi folosită și in vivo, deoarece activitatea celulei se desfășoară normal, fără a se produce alterarea enzimelor din căile metabolice.
- Poate juca și rolul unui biosenzor, datorită proprietății de a se împacheta și de a emite fluorescență.
- Poate fi utilizat și în condițiile caracterizate de o concentrație scăzută a ionilor de potasiu. Această caracteristică, îi permite folosirea în cadrul experimentelor de laborator.
Limitările iSpinach
- Afinitatea acestei versiuni pentru DFHBI nu este la capacitatea maximă, aceasta putând fi îmbunătățită.
- Nu este stabil la lumină.
Sursa: www.ncbi.nlm.nih.gov
